Здравствуйте, в этой статье мы постараемся ответить на вопрос: «Выделение Днк В Домашних Условиях». Также Вы можете бесплатно проконсультироваться у юристов онлайн прямо на сайте.
Что происходит во время эксперимента? Измельчение в блендере необходимо, так как ткань луковицы нужно разрушить до клеточного уровня. Растительные клетки окружены толстой клеточной стенкой, именно поэтому для ее разрушения необходимо активное механическое воздействие.
Детергент (моющее средство) разрушает стенки клеток и выпускает их содержимое в раствор, в том числе и ядра, в которых содержится ДНК.
Главное – не допустить последующего разрушения ДНК (его называют деградацией, то есть распадом на фрагменты). Именно для этого необходимо как можно сильнее охлаждать раствор.
Какую роль играет поваренная соль, то есть хлорид натрия? В растворе он находится в виде положительно заряженных ионов натрия и отрицательно заряженных ионов хлора. ДНК в растворе также распадается на ионы, и ее кислотный остаток будет иметь отрицательный заряд, который и будет притягиваться к положительно заряженным ионам натрия.
При добавлении спирта ДНК изменяет свою пространственную структуру, превращается в большие конгломераты (комплексы) и выпадает в виде осадка. Именно этот осадок мы и видим в виде белых нитей.
Для успешного протекания образования конгломератов и выпадения осадка спирт также должен быть сильно охлажден.
Так что, по сути, длинные белёсые нити, плавающие в растворе, это не отдельные молекулы ДНК, это скопления молекул, изменивших свою пространственную структуру под воздействием ионов натрия и спирта. Чтобы увидеть отдельные молекулы, понадобится достаточно сильные микроскоп.
Еще одна особенность опыта – в осадок выпадает не только ДНК, но и РНК, так как они обладают схожими химическими свойствами. Осаждением ДНК эту процедуру называют чисто условно.
И последнее небольшое дополнение. Для выделения ДНК в домашних условиях можно использовать не только лук. Подходят также чеснок, клубника, банан, киви.
А вот небольшое видео, как проводят выделение ДНК в лаборатории.
В основе методов ДНК-дактилоскопии лежит генетическая изменчивость человека. Нуклеотидные замены в ДНК (в зависимости от частоты в популяции, их называют также ДНК-полиморфизмами, или мутациями) делают нас индивидуально различными. Причем эти отличия могут быть найдены как в ядерных, так и в митохондриальных геномах — небольших кольцевых молекулах ДНК, которые регулируют работу митохондрий, энергетических «фабрик» клеток.
Следует отметить, что ДНК-полиморфизмы можно обнаружить в геноме каждого из нас — именно они становятся нашим неповторимым ДНК-штрихкодом. Некоторые из них могут стать причиной серьезных заболеваний [14], но в большинстве случаев они никак не влияют на нашу жизнедеятельность.
Рубрика «Комментарий эксперта»
Выделение и анализ ДНК из криминалистических образцов на первый взгляд сопоставимы с искусством. Иногда невозможно представить себе, что несколько капель крови или частички кожи под ногтями жертвы могут стать важнейшей уликой при расследовании уголовного дела. На самом деле действия криминалистов на месте преступления отточены и проходят по единому сценарию, одна из основных целей которого — поиск биологического материала, пригодного для выделения (экстракции) ДНК. Для этого могут использоваться любые биологические ткани и выделения человека: костные останки, зубы, волосяные луковицы, кровь, эпителиальные клетки, пот, слюна, образцы спермы, экскременты и т.д.
Биоматериал на вещдоках может сохраняться десятилетиями. Зачастую для исследования эксперт отбирает только часть материала — столько, сколько ему нужно для выделения ДНК. Например, при наличии на ноже следов крови, эксперт не смывает всю кровь, а делает небольшой смыв непосредственно перед выделением ДНК. При этом на ноже остаются следы, по которым через несколько десятков лет удается провести повторную экспертизу.
В клеточном ядре ДНК находится в тесном контакте с многочисленными органическими молекулами, необходимыми для ее эффективного функционирования. Однако для проведения генетического анализа из исследуемого образца должны быть удалены углеводы, липиды и белки, которые могут снижать эффективность применяемых методов и, как следствие, влиять на раскрываемость преступлений.
Сразу после экстракции ДНК перед специалистом встает вопрос о дальнейших путях ее анализа. С момента внедрения ДНК-идентификации в криминалистику методы молекулярной биологии изменились настолько, что существует сразу несколько возможных их вариантов. Наш дальнейший рассказ будет освещать разнообразные техники анализа ДНК, которые эксперты-криминалисты используют в своей практике.
Кроме идентификации человека ДНК-дактилоскопия находит применение во многих других аспектах криминалистических исследований. К ним относятся идентификация видов животных, растений и даже микроорганизмов.
Видовая идентификация является одним из важнейших компонентов в судебной практике. В некоторых случаях ДНК-дактилоскопия используется при расследовании преступлений, связанных с браконьерством или торговлей исчезающими видами [26]. Кроме того, она применяется в расследовании крупных мошеннических схем в пищевой промышленности, например, для оценки видов, присутствующих в мясных или рыбных продуктах. С целью экономии некоторые недобросовестные производители могут добавлять в свою продукцию более дешевые виды мяса, рыбы [27] или заменять животные белки растительными.
Современные методы генетического анализа позволяют различать наркосодержащие растения — в частности, каннабис. Уже сегодня разработаны STR-маркеры, с высокой долей вероятности идентифицирующие наркосодержащие и промышленные сорта конопли [28]. Так же как и с животными, методы ДНК-идентификации используются для борьбы с браконьерством и незаконным сбором растений, находящихся на грани вымирания и занесенных в красные книги.
Немаловажным направлением криминалистических исследований может стать и анализ микробиоты. Дело в том, что многие бактерии являются хорошей уликой для следствия: состав бактериальных сообществ носового платка, забытого на месте преступления, может много рассказать о его владельце, включая его диету и список сопутствующих заболеваний [29]. Комок грязи, упавший с подкрылка автомобиля, может нести информацию о последнем маршруте транспортного средства. Бактериальный состав лесных, луговых, глинистых или песчаных типов грунта значительно различается и поэтому может стать не менее эффективной уликой, чем определение местоположения по активности мобильного телефона.
Инструкция, как получить ДНК в домашних условиях Конвертация данных Средний 1 ответ
VIDEO
Сперва стопку необходимо на четверть наполнить слюной – именно из слюны, содержащей немало клеток с внутренней стороны щек, и предполагается извлекать ДНК. После этого нужно добавить несколько капель моющего средства. Входящие в его состав поверхностно-активные вещества вызывают лизис клеток – их мембраны разрушаются, а содержимое попадает в раствор.
Интернет-ресурс Popular Science представил своим пользователям видеоинструкцию по выделению ДНК в домашних условиях. Для этого потребуется стеклянная стопка, средство для мытья посуды, ананасовый сок, поваренная соль, крепкий алкоголь, трубочка для напитков и зубочистка.
изучить литературу по данной теме, определить строение и функции ДНК
изучить методику выделения ДНК
подготовить оборудование для проведения опыта в домашних условиях
опробовать методику выделения ДНК, используя клетки растительных организмов
выделить ДНК человека
создать обучающий видеоролик «Выделение ДНК человека в домашних условиях»
Характеристика Банан — одно из самых древних культивируемых растений. Его родиной считаются острова Малайского архипелага. Банан — название многолетней травы из семейства Банановых.В наши дни среди выращиваемых культур банан уступает лишь пшенице, рису и кукурузе, занимая четверное почетное место. Его выращивают практически во всех странах, лежащих в теплом климатических поясах.
История открытия 1869 г. Фридрих Мишер обнаружил НК и дал им название («нуклеус»-ядро). 1905 г. Эдвин Чаргафф изучил нуклеотидный состав НК. 1950 г. Розалинда Франклин установила, двухцепочечность ДНК. 1953 г. американские биохимики Дж. Уотсон и Ф.Крик установили расположение частей молекулы ДНК
В общем, если перед исследователем не стоит какой-то специальной задачи, он старается выбрать для работы ткань, в которой мало межклеточного вещества и много самих клеток. Причем желательно, чтобы ткань легко распадалась на эти составляющие, а клетки не были перегружены белками (как мышечные), липидами (как жировые) или полисахаридами (как клетки мозга).
Теперь ДНК плавает в растворе сама по себе. Белки больше не цепляются за нее, хотя обломков всевозможных молекул в смеси по-прежнему много. В лабораторных условиях эти ненужные фрагменты убирают, тщательно перемешивая раствор с фенолом и/или хлороформом. После центрифугирования внизу пробирки оказываются фенол и/или хлороформ с растворенными в них белками, а вверху — водная фаза, содержащая ДНК. Водную фазу собирают в отдельную пробирку и дальше работают уже с относительно чистым раствором.
Должно получиться немного раствора, где-то миллилитров 5-10. Аккуратно переливаем их в высокий узкий стеклянный сосуд. Например, я использовала бутылочку от детского сока. Теперь очень аккуратно по стеночке приливаем спирт (не забыли, что он должен быть холодным?) к фильтрату. Вам понадобится столько же спирта по объему, сколько получилось отфильтрованного раствора.
Берем чайную ложку этой кашицы, перекладываем с ступку, добавляем чайную ложку средства для мытья посуды (например, я брала Fairy), приливаем две столовые ложки охлажденного буфера и очень тщательно давим пестиком в течение 3-4 минут. Да, это долго и нудно, но необходимо для разрушения клеток лука.
Как передаётся информация внутри живых существ? Как от одного поколения в другое передается информация о зарождении именно рыжего кота, а не белого? Как и где она хранится? На чём она «путешествует»? Меня это заинтересовало. Оказывается ответ известен: эта удивительная «информационная молекула» называется ДНК. Эта информация, «путешествующая» в молекуле ДНК от матери и отца к их потомству, является «инструкцией», которая позволяет механизму в оплодотворенной клетке строить новый живой организм. Я узнал,что ДНК можно выделить в домашних условиях, я решил получить ДНК.
Как передаётся информация внутри живых существ? Как от одного поколения в другое передается информация о зарождении именно рыжего кота, а не белого? Как и где она хранится? На чём она «путешествует»? Меня это заинтересовало. Оказывается ответ известен: эта удивительная «информационная молекула» называется ДНК. Эта информация, «путешествующая» в молекуле ДНК от матери и отца к их потомству, является «инструкцией», которая позволяет механизму в оплодотворенной клетке строить новый живой организм. Я узнал,что ДНК можно выделить в домашних условиях, я решил получить ДНК.
Как получить ДНК в домашних условиях В домашних условиях проверить факт биологического родства не получится. Тестирование ДНК дома заключается в заборе буккального эпителия. Это можно сделать самостоятельно, используя специальный набор приспособлений и следуя инструкции.
Полученный материал отправляется в медицинскую лабораторию. Специалисты используют биологические данные отца и ребенка.
Для получения более достоверного результата и упрощения процедуры, дополнительно потребуются клетки матери. Чтобы результаты ДНК-теста являлись полноценным доказательством и использовались в дальнейшем, необходимо соблюсти определенную процедуру забора материала.
Рекомендуется учитывать такие нюансы, как:
использование специального стерильного набора, полученного из медицинского центра;
четкое следование прилагаемой инструкции во время забора материала;
упаковывание результата в конверт и его отправление в лабораторию для исследования.
Набор для проведения теста ДНК в домашних условиях
Если процедура получения ДНК в домашних условиях не соблюдена (например, используется набор не из лаборатории или материал неверно упакован), ее результаты не будут являться достоверным доказательством для предъявления в суде. Чтобы не допустить подобных ошибок, необходимо более подробно изучить инструкцию по получению ДНК дома.
Головку ватной палочки категорически запрещено трогать руками. Ее необходимо взять за обрезанный конец. Во время процедуры делается минимум 10-12 движений вверх-вниз по внутренней поверхности щеки, плотно прижав головку палочки к слизистой оболочке.
Процедура ДНК теста не занимает много времени (в среднем, 4-5 минут), является безопасной и безболезненной для взрослых и детей.
Сначала сотрудник медицинского центра присылает материалы для забора буккального эпителия, в этот комплект входит:
подробная инструкция;
стерильные палочки;
разноцветные конверты.
Забор образцов производится при соблюдении следующих правил:
подготовить материалы – ватные палочки и бумажные конверты в определенном количестве на каждого человека, участвующего в исследовании. Лучше заказать такой набор в лаборатории;
правильно заполнить конверты. На каждом из них следует указать фамилию, имя, отчество, число, месяц и год рождения, степень родства, а также дату забора биоматериала. Если процедура является анонимной, то вместо Ф.И.О. указывается номер;
взять мазок с внутренней поверхности щеки у всех проверяемых людей. Каждому потребуется две палочки, у которых следует срезать по одной ватной головке. Если один из проверяемых людей – уже родившийся ребенок, проверяться будет он и предполагаемый отец. Когда нужно провести тест на отцовство во время беременности женщины, требуется образец буккального эпителия мужчины (или иной вид образца) и кровь матери. В последнем случае проводить данную процедуру необходимо в специализированном учреждении;
подержать палочку после мазка на открытом воздухе около 1 минуты для испарения излишней влаги;
поместить образец в чистый конверт, внутреннюю поверхность которого нельзя задевать руками. Запечатывание конвертов производится строго с помощью клейкой полосы;
полностью провести процедуру повторно, взяв мазок с другой стороны щеки;
направить конверты с образцами в лабораторию.
Итак, в домашних условиях можно только получить биоматериал, дальнейшее его исследование проводится исключительно опытными экспертами, в стенах лаборатории.
Достоверность и максимальная точность сделали ДНК-тесты столь популярной, а также незаменимой процедурой в сфере медицинских исследований и юридических доказательств. Генетическая экспертиза помогает без ошибок идентифицировать личность человека, установить степень родства или диагностировать сложные наследственные заболевания.
Точность теста ДНК зависит, в первую очередь, от степени глубины проведенного исследования и объема взятого материала. Для получения максимально точного результата, требуется анализировать больше фрагментов ДНК. Как уже говорилось выше, стандартный образец буккального эпителия берется со слизистой оболочки щеки.
Если невозможно получить буккальный эпителии, рекомендуется воспользоваться образцами другого происхождения:
часть обрезанного ногтя;
пятно крови или сперма;
предметы личной гигиены или одежды.
Несмотря на нестандартность этих биоматериалов, есть шанс добиться не менее точного результата исследования ДНК. На правдивость теста также влияет уровень профессионализма специалиста и правильность получения образцов.
Согласно Международным стандартам 1991 года, вероятность исключений не должна быть ниже 99,99% для совокупности маркеров, необходимых для исследования ДНК-теста на отцовство.
В биологии также существует конкретная формулировка: точность теста зависит от частоты присутствия аллелей (различных форм одного и того же гена), передаваемых от отца ребенку.
Если биологическое родство подтверждается, его показатель рассчитывается следующим образом:
сначала определяется индекс по каждому локусу. Общий показатель (CPI) – это произведение коэффициентов по всем локусам;
далее вводится показатель вероятности в относительном выражении, который имеет значение 1,0: (1,0 + CPI).
Максимальная вероятность биологического родства при положительном результате составляет 99,999999%. Но, если в ходе анализа не выявлены совпадения фрагментов ДНК предполагаемого отца и ребенка, дается стопроцентный отрицательный результат.
Сегодня, получить информацию об отцовстве могут все сомневающиеся мужчины, благодаря гениальному изобретению — домашнему тесту ДНК. Что это за анализ, что нужно для его проведения и какова достоверность полученного результата, мы расскажем вам в этой статье.
Впервые услышав об анализе ДНК на отцовство в домашних условиях, многие представляют себе нечто на подобии мини-лаборатории или приспособление типа теста на беременность.
Но нет, на самом деле домашним тест ДНК на отцовство называется только потому, в домашних условиях проводится забор биоматериала, который в дальнейшем направляется в лабораторию.
По сути это специальный набор, состоящий из стерильных палочек, разноцветных конвертов и видео-инструкции с подробным описанием, как правильно провести процедуру забора клеток (буккального эпителия) с внутренней поверхности щеки.
Забор биологического материала обязательно проводится у предполагаемого отца и ребенка, клетки матери упрощают исследование, но обязательными не считаются. Получив буккальный эпителий, его помещают в специальный конверт и отправляют в лабораторию, где непосредственно проводится сопоставление ДНК отца и ребенка.
В стандартном тесте отцовства ДНК тестируемые стороны включают ребенка, предполагаемого отца и мать. Участие матери в тесте отцовства позволяет исключить половину ДНК ребенка, оставляя другую половину для сравнения с ДНК предполагаемого отца.
Тем не менее, мы можем выполнить тест на отцовство без участия матери. Тест без матери включает в себя дополнительный анализ, который DDC выполняет без дополнительной оплаты.
Как делается ДНК-тест: этапы проведения Для выделения ДНК в домашних условиях вам понадобится: чистый стаканчик, слюна (источник ДНК), средство для мытья посуды, поваренная соль, ананасовый сок (или раствор для очистки контактных линз), крепкий охлажденный алкоголь (ром), соломенная трубочка для напитков и зубочистка (или стеклянная палочка).
На первом этапе необходимо на четверть наполнить стаканчик слюной, так как именно в слюне имеются клетки многослойного эпителия щек, из которых будет извлекаться ДНК. Если она вырабатывается в недостаточном количестве, то, согласно совету Popular Science, нужно представить, что вы рассасываете во рту карамель.
Как передаётся информация внутри живых существ? Как от одного поколения в другое передается информация о зарождении именно рыжего кота, а не белого? Как и где она хранится? На чём она «путешествует»? Меня это заинтересовало.
Оказывается ответ известен: эта удивительная «информационная молекула» называется ДНК. Эта информация, «путешествующая» в молекуле ДНК от матери и отца к их потомству, является «инструкцией», которая позволяет механизму в оплодотворенной клетке строить новый живой организм.
Я узнал,что ДНК можно выделить в домашних условиях, я решил получить ДНК.
Как передаётся информация внутри живых существ? Как от одного поколения в другое передается информация о зарождении именно рыжего кота, а не белого? Как и где она хранится? На чём она «путешествует»? Меня это заинтересовало.
Оказывается ответ известен: эта удивительная «информационная молекула» называется ДНК. Эта информация, «путешествующая» в молекуле ДНК от матери и отца к их потомству, является «инструкцией», которая позволяет механизму в оплодотворенной клетке строить новый живой организм.
Я узнал,что ДНК можно выделить в домашних условиях, я решил получить ДНК.
Ещё один метод выделения молекулы, он заключается в том, что в исследуемый образец добавляются магнитные шарики и специальное лизирующие средство. Шарики связывают выделившуюся ДНК, а в процессе очищения происходит вымывание оставшихся клеточных элементов. Завершающим шагом становится элюирование молекулы низко солевым буфером.
Из недостатков можно говорить лишь о стоимости исследования, она сравнительно высока по отношению к другим методам. Из плюсов определяют:
· возможность выделять большое количество нуклидов за счёт большого объёма сорбента;
· в момент выделения минимизированы потери;
· малый риск перекрёстной контаминации, так как почти все нуклеиновые молекулы связываются сорбентом;
· масштабность методики;
· высокое качество продукта на выходе.
По определению, метод позволяет быстро разделить молекулы в соответствии с их размерами. Сам гель сформирован в виде гранул, расположенных поперечно, напоминая собою трёхмерную, молекулярную сетку или сито. В момент пропускания материала через колонку, наполненную этим гелием, происходит разделение веществ. После чего проводится очистка этилом или фенолом. Преимущество метода быстрота выполнения, из недостатков небольшое количество полученного материала.
Специфика выделения ДНК из растительных объектов Независимо, какой из методов будет использоваться, требуется тщательная подготовка рабочего места и лаборатории в целом. За час до начала исследования рабочую поверхность, штативы и прочее оборудование обеззараживают ультрафиолетом на протяжении 60 минут. По завершении работы дезинфекцию повторяют. Дополнительно, перед тем как приступить к процессу, столы обрабатывают 70% этиловым спиртом, полы также подвергаются дезинфекции специальными средствами. Всю необходимую пластиковую посуду (наконечники, пробирки, колбы) помещают на сутки в специальный контейнер, где она дезинфицируется 10% раствором хлорной извести и 5% хлорамина. А все сотрудники лаборатории обязаны быть в стерильной медицинской одежде, полностью закрывающей тело, а также тапочках, шапочках и резиновых перчатках. Все эти меры предпринимаются для того, чтоб не допустить загрязнение образца.
Как видно из описанного выше процесса, выделение ДНК, очень кропотливый труд, требующий стерильности, специального оборудования, серьёзной подготовки специалиста и, конечно, знаний. Для того чтоб получить поистине качественный образец следует придерживаться чёткой, пошаговой инструкции. Генетика — это не та наука, которая позволяет допустить оплошность, один неверный шаг и материал для исследования испорчен, а ДНК не получено, а ведь далеко не всегда у лаборанта есть возможность получения дополнительного образца.
Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статьях с 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот в большинстве исследовательских лабораторий.
Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в определенных пропорциях и последующем перемешивании и центрифугировании смеси.
При выделении нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как Фенол/Хлороформ или Тризолом с последующим осаждением в Изопропиловом спирте. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть достигнуто добавлением перхлората натрия.
При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы: водная и органическая, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК. Дополнительно можно попробовать селективное инкубирование с хлоридом лития или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидин хлоридом или гуанидин тиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях.
Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени.
Сорбционная экстракция – методика, в основе которой лежит избирательная сорбция на поверхности silica в присутствие хаотропной соли. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.
Технология выделения на silica-spin колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках silica, предложенный американскими учёными в 1979 году. Метод колоночного выделения использует то же свойство нуклеиновых кислот адгезироваться на поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.
Чаще всего для лизиса используются хаотропные агенты, например гуанидин тиоцианат, которые дестабилизируют водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. В таких условиях растворимость ДНК/РНК в воде снижается, а белки денатурируют. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.
Хаотропная соль необходима не только для лизиса, но и для процесса сорбции нуклеиновых кислот. Также для усиления процесса сорбции в некоторых протоколах рекомендуют добавлять спирт. Нужно отметить, что сорбция ДНК на силике под действием хаотропных солей – процесс, который по-прежнему вызывает много споров. Однако среди всех существующих точек зрения на процесс взаимодействия ДНК с силикой можно выделить несколько основных.
Первая точка зрения состоит в том, что сорбция ДНК на силике происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности силики и фосфатными группами ДНК. Известно, что в растворе при рН 6 – 8 поверхность силики отрицательно заряжена, как и фосфатные группы НК. Из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности силики за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.
Вторая точка зрения опирается на свойства хаотропных агентов. Известно, что молекула НК в растворе покрыта гидратной оболочкой. Попадая в раствор, молекулы хаотропной соли активно разрушают водородные связи, присоединяя к себе воду. В итоге молекула ДНК, лишённая своей гидратной оболочки, становится гидрофобной. То же самое происходит с поверхностью силики. В итоге между ДНК и силикой возникают гидрофобные взаимодействия, и идёт процесс сорбции.
Согласно еще одной точке зрения основным механизм взаимодействия ДНК и силики является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор силики.
Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул НК. Авторы подчеркивают, что НК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул торчит на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятными вариантами механизма сорбции представляются первые два, которые являются взаимодополняющими.
Необходимо также отметить, что процесс сорбции лучше всего идет при высокой ионной силе раствора, показателях рН 3,5-6,5 (оптимум рН 5) и температуре выше 37 °С.
Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.
Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.
Криминалистика. Молекулярно-генетическая экспертиза Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют.
Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.
Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие.
Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.
Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.
Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.
На данный момент в нашей компании ВМТ разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:
Набор на основе сорбционной экстракции. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
Набор на основе спиртового осаждения. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
Набор для выделения нуклеиновых кислот методом сорбции на silica-spin колонках – наиболее интересная и перспективная разработка.
Достоверность и максимальная точность сделали ДНК-тесты столь популярной, а также незаменимой процедурой в сфере медицинских исследований и юридических доказательств. Генетическая экспертиза помогает без ошибок идентифицировать личность человека, установить степень родства или диагностировать сложные наследственные заболевания.
Точность теста ДНК зависит, в первую очередь, от степени глубины проведенного исследования и объема взятого материала. Для получения максимально точного результата, требуется анализировать больше фрагментов ДНК. Как уже говорилось выше, стандартный образец буккального эпителия берется со слизистой оболочки щеки.
Выделение молекулы ДНК в домашних условиях Отец-Мать Единый, по твоему образу и подобию Я Есть, что Я Есть и Я приказываю Активации моих хромосом “Молодости ” и “Жизнестойкости ” быть выполненной во мне…… имя_____ Сего Дня______ число, месяц, день недели, время суток, в городе….
Позволь Золотой и Белой Энергии Любви и Жизни войти в меня сверху. Покажи мне шишковидную железу…. Покажи мне мою Великую центральную Клеточку…. Покажи мне мои хромосомы Молодости и Жизнестойкости …..Покажи мне их ДНК….
Отец-Мать Единый, по твоему образу и подобию Я Есть , Что Я Есть и Я приказываю Активации моих хромосом Молодости и Жизнестойкости Быть проведённой во Мне СЕЙЧАС…..Я командую Нитям ДНК “Общения ” Сложиться и Объединиться сверху моей существующей ДНК….
VIDEO
Опыт несложный, делается легко и быстро, займет, от силы, минут 20. Честно говоря, приготовления к нему занимают гораздо больше времени.
Например, залить воду в какие-нибудь емкости и выставить на балкон, благо сейчас зима.
Если такой экстрим вам не нравится, тогда делаем все культурно – в формочки для льда заливаем воду и ставим в морозилку.
Второе этап подготовки – купленному спирту также придется померзнуть в морозилке или на улице – чем холоднее он будет, тем лучше.
Наливаем 120 мл дистиллированной воды в стакан и добавляем половину чайной ложки поваренной соли и 1 чайную ложку пищевой соды. Получается так называемый буферный раствор.
Ставим его охлаждаться в кастрюльку или любую другую емкость, заполненную льдом.
Пока охлаждается, готовим биологический материал, луковицу. Нарезаем ее кусочками и тщательно перемалываем в блендере. Это очень важный этап – механическое разрушение тканей, чтобы потом было легче воздействовать на них химическими веществами.
Именно на этом этапе я и проливала слезы от запаха лука. Совершенно не переношу его – мои глаза болят потом весь вечер, как их не промывай.
Должна получиться однородная масса, кашица с соком.
Берем чайную ложку этой кашицы, перекладываем с ступку, добавляем чайную ложку средства для мытья посуды (например, я брала Fairy), приливаем две столовые ложки охлажденного буфера и очень тщательно давим пестиком в течение 3-4 минут. Да, это долго и нудно, но необходимо для разрушения клеток лука.
Жидкость для мытья посуды (детергент) здесь играет роль разрушителя мембран клеток, чтобы молекула ДНК смогла выйти в раствор.
Дальше нужно отделить раствор от оставшихся твердых частиц. Для этого либо фильтруем через воронку и фильтр, сделанный из обычной салфетки или бумажного полотенца, либо через марлю. Я выбрала второй способ – свернула марлю в четыре слоя и отфильтровала раствор через нее.
Должно получиться немного раствора, где-то миллилитров 5-10. Аккуратно переливаем их в высокий узкий стеклянный сосуд. Например, я использовала бутылочку от детского сока. Теперь очень аккуратно по стеночке приливаем спирт (не забыли, что он должен быть холодным?) к фильтрату. Вам понадобится столько же спирта по объему, сколько получилось отфильтрованного раствора.
На этой неделе в журнале Nature вышла статья с описанием новой технологии, которая могла бы помочь Хэ Цзянькую успешно провести эксперимент. Американские генетики модифицировали CRISPR-Cas9 и научили ее эффективно исправлять большинство видов мутаций, которые приводят к развитию болезней человека. Чтобы объяснить, в чем заключается новшество, вспомним сначала, как работает CRISPR-Cas9.
В основе системы лежат два компонента — белок Cas9, выступающий в роли «ножниц» для ДНК, и короткая молекула-гид, задача которой — направить «ножницы» в нужное место генома, где Cas9 мог бы сделать разрез.
После того, как молекула-гид находит нужный участок, Cas9 разрезает обе цепи спирали ДНК.
Затем, чтобы внести в геном нужное нам изменение, в систему надо добавить третий компонент — так называемую «заплатку», фрагмент ДНК с нужной последовательностью, которую системы ремонта смогут использовать как образец для починки хромосомы.
Важно подчеркнуть, что само по себе появление в ДНК двуцепочечных разрывов обычно рассматривается клетками как очень опасное событие, ведь оно чревато хромосомными перестройками или вообще запуском программы клеточного самоубийства — апоптоза.
В каждой клетке поэтому эволюционно предусмотрена аварийная защита на случай таких разрывов (в природе они появляются, например, в результате действия радиации). Чаще всего при этом ферменты системы защиты просто находят и «склеивают» концы ДНК как попало.
На месте разрыва тогда может появиться небольшая мутация в виде пропущенной (делеция) или вставленной лишней буквы (инсерция). Несмотря на то, что это вроде бы лишь точечное изменение, оно может приводить к .
Одна из главных проблем с технологией редактирования в ее текущем виде заключается в том, что в клетках человека (в отличие от, например, дрожжей), точный ремонт на основе ДНК-образца — тот, на который рассчитывают ученые — идет с гораздо меньшей эффективностью, чем срочный, но неаккуратный аварийный ремонт. Именно поэтому у Хэ Цзянькуя не получилось отредактировать геномы близнецов так, как это было задумано.
Несколько дней назад в Москве прошла встреча, на которой специалисты в области биомедицины обсудили, насколько вмешательство на генетическом уровне реально необходимо для победы над болезнями.
Пресс-конференция была созвана по поводу приезда американского корреспондента из журнала Science Джона Коэна, который захотел лично пообщаться с последователем Хэ Цзянькуя — российским генетиком, заведующим лабораторией геномного редактирования Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Денисом Ребриковым.
Ребриков сообщил, что собирается провести подобный эксперимент для исправления на уровне эмбриона мутации, приводящей к наследственной глухоте.
Для этого он даже нашел добровольцев — семейную пару, в которой оба родителя несут по две копии мутации.
Впрочем, как рассказала изданию N+1 и впоследствии Science потенциальная мать генно-модифицированного ребенка, ее участие в проекте пока под вопросом — она опасается, что это может быть небезопасно.
В отличие от Хэ, Ребриков открыто заявил о своих планах и даже решил согласовать эксперимент в Минздраве. В России опыты с эмбрионами находятся в «серой» правовой зоне — они не запрещены напрямую, на что и надеялся ученый при планировании работы. Пока официальные органы не дали никакого ответа, но инцидент спровоцировал новую волну обсуждений в мировом научном сообществе.
Основные доводы оппонентов Ребрикова и Хэ заключаются в том, что для лечения многих генетических болезней внесение изменений в геном ребенка просто не нужно — даже безотносительно «сырости» технологии.
Дело в том, что эксперимент по редактированию возможен только при применении экстракорпорального оплодотворения, когда зачатие происходит «в пробирке».
Но если родители уже обращаются к ЭКО, почти всегда эмбрионы, несущие мутации, можно отсечь на этом этапе — без всякого редактирования, просто проведя генетический анализ получившихся эмбрионов.
Случаев, когда это сделать невозможно из-за того, что оба родителя несут по две копии мутантных генов (и появления здорового эмбриона просто невозможно), немного.
Именно такую пару, страдающую наследственной глухотой, выбрал Ребриков, чтобы обосновать необходимость редактирования.
Впрочем, его оппоненты полагают, что даже в таком случае поводов для вмешательства в геном недостаточно, потому что глухоту можно исправить установкой специального импланта.
Надо заметить, что авторы новой статьи не предлагают начать исправлять геном эмбрионов.
Кроме клеток зародышевой линии, изменение которых приведет к развитию полностью генно-модифицированного организма, можно вносить изменения в геном отдельных клеток — например, клеток крови.
Эксперимент проходит ex vivo, то есть вне организма человека, после чего измененные клетки возвращаются обратно.
Материалы
ДНК-тесты весьма разнообразны, но процедура их проведения проходит по одному и тому же принципу. Есть общая цепочка событий, которую проходят далеко не все тесты: например для выявления в образце наличия вирусов и инфекции нет необходимости секвенировать ДНК, а достаточно выявления одной чужеродной молекулы в образце.
Сбор и получение лабораторией биообразца для исследования.
Выделение из образца клеток и их синтез путем полимеразной цепной реакции. На этой стадии создается необходимое для тестирование количество молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты.
Секвенирование – определение последовательности генов в молекуле ДНК.
Необходимые для исследования участки генов подкрашиваются флуоресцентной краской.
Подкрашенные участки генов подвергаются воздействию направленного лазерного луча, что позволяет точно из визуализировать и исследовать.
Расшифровка полученных данных и написание врачебных рекомендаций.
Вконтакте
Facebook
Google+
Одноклассники
Похожие записи:
